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Diversi tipi di PCR
Reazione a catena della polimerasi (PCR) è ampiamente classificato sulla base di lievi modifiche nel processo PCR standard. I diversi tipi di PCR sono i seguenti:
- PCR annidata
- PCR inversa
- PCR con trascrizione inversa (RT-PCR)
- PCR asimmetrica
- PCR quantitativa (Q-PCR)
- PCR quantitativa in tempo reale (QRT-PCR o RTQ-PCR)
- PCR touchdown
- PCR di colonia
- PCR allele-specifica
- Polymerase Cycling Assembly (PCA) o Assembly PCR
- PCR lineare dopo l'esponenziale (LATE-PCR)
- PCR dial-out
- Amplificazione dipendente dall'elicasi
- PCR con avvio a caldo
- PCR specifica inter-sequenza
- PCR mediata dalla legatura
- PCR specifica per la metilazione
PCR annidata
Questa tecnica è proposta per ridurre i contaminanti nel DNA amplificato a causa dell'amplificazione del legame dei primer casuali. La PCR annidata viene eseguita con due diversi set di primer in due cicli PCR consecutivi. Il set successivo dovrebbe amplificare il target secondario all'interno del prodotto della corsa primaria. Questa tecnica ha un successo eccezionale, sebbene richieda molta più conoscenza delle sequenze coinvolte.
PCR inversa
Viene eseguita quando è nota solo una singola sequenza interna del DNA stampo. Questa tecnica è adatta all'identificazione delle sequenze fiancheggianti ai vari inserti genici. Il processo include una sequenza di digestione e autolegatura del DNA stampo, che si traduce in pezzi di DNA con sequenze note alle estremità di una sequenza sconosciuta.
PCR con trascrizione inversa (RT-PCR)
Viene utilizzato per amplificare e identificare sequenze note da librerie di RNA. L'RNA ottenuto dal campione viene quindi convertito in DNA complementare (cDNA) dall'azione dell'enzima trascrittasi inversa dell'enzima. Successivamente è stata eseguita una tipica PCR. La RT-PCR è ampiamente utilizzata nell'identificazione e nella determinazione dell'espressione genica.
PCR asimmetrica
Amplifica selettivamente un filamento del DNA stampo più dell'altro. Viene utilizzato nel sondaggio di ibridazione in cui un solo filamento è considerato ideale. Un'ulteriore amplificazione si ottiene effettuando una PCR standard in presenza di primer in eccesso per il filamento scelto.
PCR quantitativa (Q-PCR)
Questa è la procedura indiretta per misurare le quantità iniziali di RNA, cDNA o DNA stampo. La Q-PCR viene generalmente utilizzata per determinare rapidamente la quantità di prodotto della PCR. La Q-PCR viene utilizzata anche per la rilevazione di sequenze specifiche all'interno del campione di DNA.
PCR quantitativa in tempo reale (QRT-PCR o RTQ-PCR)
Questo processo utilizza coloranti fluorescenti per monitorare e misurare quantità in tempo reale di prodotti amplificati. Questa PCR quantitativa in tempo reale viene utilizzata in coniugazione con QPCR.
PCR touchdown
Questa tecnica riduce il legame del primer non specifico diminuendo la temperatura di annealing tra due cicli consecutivi di PCR.
PCR di colonia
I cloni (es. E. coli) vengono analizzati per i prodotti di legatura corretti. La colonia specifica viene raccolta attraverso uno stuzzicadenti sterile e introdotta nella master mix. La PCR viene utilizzata con un tempo esteso a 95oC.
PCR allele-specifica
Questa tecnica si basa sul polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), la PCR allele-specifica viene spesso utilizzata per la clonazione e per scopi diagnostici. È richiesta una conoscenza preliminare della sequenza del DNA degli alleli e della loro differenza. La PCR allele-specifica prevede l'uso di primer SNP contenenti l'estremità 3 '. Il successo dell'amplificazione PCR allele-specifica e dei primer specifici per SNP indicano la presenza di un particolare SNP nella sequenza.
Polymerase Cycling Assembly (PCA) o Assembly PCR
Coinvolge la produzione artificiale delle lunghe sequenze di DNA in presenza di lunghi oligonucleotidi e brevi segmenti sovrapposti seguendo la procedura PCR standard. Gli oligonucleotidi lunghi ruotano in entrambe le direzioni (senso e anti-senso), il segmento sovrapposto decide l'ordine dei frammenti di PCR, facilitando la produzione selettiva del DNA lungo finale.
PCR lineare dopo l'esponenziale (LATE-PCR)
In questa tecnica, il primer limitante (primer presente nella quantità inferiore) ha un punto di fusione più alto rispetto al primer in eccesso (primer presente in quantità sufficiente) per mantenere l'efficienza della reazione poiché la concentrazione del primer limitante diminuisce nel mezzo della reazione .
PCR dial-out
È un metodo per recuperare le molecole di DNA per la sintesi genica. Una libreria di DNA viene modificata con specifici tag fiancheggianti prima del sequenziamento. Successivamente, i primer diretti al tag consentono il recupero del DNA delle sequenze desiderate mediante PCR.
Amplificazione dipendente dall'elicasi
È correlato alla PCR tradizionale, ma utilizza una temperatura costante invece di ciclare. La DNA elicasi viene utilizzata al posto della fase di denaturazione termica.
PCR con avvio a caldo
Questa tecnica ha escluso la possibilità di un'amplificazione aspecifica durante i cicli iniziali di PCR. Gli ingredienti di reazione vengono riscaldati alla temperatura di denaturazione che è 95oC prima dell'aggiunta della polimerasi. Gli inibitori e gli anticorpi vengono introdotti nella miscela di reazione per inibire DNA polimerasi attività, che si dissocia alle alte temperature.
PCR specifica inter-sequenza
Questa modifica della tecnica PCR viene spesso utilizzata per il fingerprinting del DNA, che richiede l'amplificazione di regioni poste tra le ripetizioni di sequenze semplici per generare un'impronta digitale / modello unico e specifico di frammenti di DNA amplificati.
PCR mediata dalla legatura
Utilizza specificamente piccole molecole linker di DNA (da inserire) e vari primer capaci di ricottura con il DNA linker. Questa tecnica è ampiamente utilizzata per il sequenziamento del DNA e l'impronta del piede.
PCR specifica per la metilazione
Questa tecnica viene utilizzata per la rilevazione delle isole CpG nel genoma. Nella PCR specifica per la metilazione, il DNA viene trattato con bisolfato di sodio, che converte la base della citosina non metilata in uracile, identificato / riconosciuto dalle basi timina del primer PCR. Due diversi set di PCR vengono eseguiti sul DNA alterato utilizzando set di primer identici ad eccezione delle isole CpG dei primer. I set di primer riconoscono le basi della citosina e altri set di primer riconoscono l'uracile per amplificare il DNA non metilato. La Q-PCR può essere eseguita anche per conoscere le informazioni quantitative riguardanti la metilazione.
MCQ concettuali su diversi tipi di PCR (risolto)
Domanda 1: Un ricercatore sta cercando di alterare cinque coppie di basi successive nel mezzo di frammenti di DNA amplificati dalla PCR. Qual è la tecnica più consigliata per eseguire tale esperimento?
Legatura A-DNA
B- Saggio elettroforetico di spostamento della mobilità (EMSA)
Mutagenesi C- PCR
D- Enzima di restrizione digestione
Risposta corretta: Opzione C Mutagenesi PCR
Spiegazione:
La tecnica più raccomandata per questo tipo di modifiche è la mutagenesi PCR. Può sintetizzare primer che si legano in modo imperfetto al sito di mutagenesi desiderato. Questi primer conterranno ora la nuova sequenza di 5 coppie di basi da introdurre nel nuovo filamento di DNA. In primo luogo, la PCR amplierà il frammento di DNA contenente la sequenza mutante e le sequenze a monte. Il secondo ciclo di PCR amplierà il nuovo filamento di DNA contenente la sequenza mutante e anche le sequenze a valle. E il ciclo finale di PCR amplificherà un frammento di DNA dai due modelli, utilizzando i primer originali per amplificare il filamento di DNA a lunghezza intera.
Domanda 2: La reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizza una polimerasi stabile al calore (Taq polimerasi) per amplificare il filamento di DNA. Quale delle affermazioni descrive meglio perché le polimerasi termostabili sono necessarie per la PCR?
La A-PCR necessita di cicli termici e le Taq polimerasi possono essere inattivate poiché non sono necessarie durante le fasi a bassa temperatura.
B- La polimerasi stabile al calore (Taq) non rompe il dsDNA a meno che la temperatura non sia molto alta. Pertanto è necessaria una polimerasi stabile al calore (Taq).
La C-PCR necessita di cicli termici e le polimerasi termostabili (Taq) non si denatureranno per perdere efficacia nella polimerizzazione del DNA durante l'alta temperatura (95oC) passaggio.
D- L'interazione tra cationi bivalenti e DNA polimerasi è molto efficiente durante i passaggi ad alta temperatura. Pertanto la PCR richiede DNA polimerasi stabile al calore.
E- Le polimerasi stabili al calore (Taq) sono più economiche delle polimerasi standard; quindi, sono più adatti per amplificare il DNA.
Risposta corretta: opzione C.
La PCR necessita di cicli termici e le polimerasi termostabili (Taq) non si denatureranno per perdere efficacia nella polimerizzazione del DNA durante l'alta temperatura (95oC) passaggio. Questo lo rende unico tra i diversi tipi di PCR.
Spiegazione:
Le polimerasi spesso si denaturano a temperature più elevate. Se fosse utilizzata una polimerasi standard, si denaturerebbe durante la fase ad alta temperatura (denaturazione), necessaria per rompere il DNA a doppio filamento in modelli di DNA a filamento singolo. Utilizzando questa polimerasi termostabile (Taq), il l'enzima non si denatura. I filamenti di DNA continueranno ad amplificarsi dalla Taq polimerasi aggiunta all'inizio della PCR.
Domanda 3: qual è l'ordine corretto delle tre fasi della PCR?
A- Estensione, denaturazione, ricottura
B- Denaturazione, ricottura, allungamento
C- Ricottura, estensione, denaturazione
D- Denaturazione, estensione, ricottura
Risposta corretta: opzione B
Denaturazione, ricottura, allungamento
Spiegazione:
Le fasi della PCR prevedono denaturazione, ricottura ed estensione.
La denaturazione viene eseguita a una temperatura intorno ai 94-98 ° C per rompere i legami idrogeno del DNA a doppio filamento.
La ricottura è la seconda fase della PCR completata a 50-65 ° C. La fase di ricottura deve essere eseguita a bassa temperatura per il fissaggio dei primer al singolo filamento, ma sufficientemente alta da evitare ibridazioni aspecifiche.
La fase di estensione o allungamento della PCR consente alla DNA polimerasi di sintetizzare l'ultima copia del filamento di DNA stampo. La temperatura ottimale dipende dalla DNA polimerasi utilizzata, ma di solito è compresa tra 75 e 80 ° C.
Domanda 4: quale dei seguenti è / non è un componente di una miscela di reazione a catena della polimerasi?
A- Soluzione tampone
B- DNA polimerasi
C- Formammide
D-DNA stampo filamento
Risposta corretta: opzione C.
Formammide
Spiegazione:
Gli ingredienti della PCR sono DNA (Taq) polimerasi, tampone, primer, cloruro di magnesio, dNTP (adenina, guanina, citosina, timina), trifosfati di deossinucleotide e il filamento stampo di DNA.
Conclusioni
In questo articolo abbiamo discusso diversi tipi di PCR. Per ulteriori informazioni su questo argomento, visitare diversi tipi di PCR.
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