Riparazione dell'escissione del nucleotide e polimorfismo del singolo nucleotide

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Riparazione per escissione di nucleotidi

Il meccanismo di riparazione per escissione è un metodo standard per la riparazione del frammento di DNA non corrispondente o danneggiato. Il processo di riparazione per escissione comporta il taglio, la rimozione e la ri-sintetizzazione della porzione di DNA non corrispondente o danneggiata. Sono stati descritti tre distinti meccanismi di riparazione per escissione di estrazione: riparazione di mismatch, riparazione per escissione di basi e riparazione per escissione di nucleotidi. Tutti i meccanismi sopra menzionati seguono un semplice formato di fasi di taglio, duplicazione e legatura. Nella fase di taglio, un complesso enzimatico elimina il frammento danneggiato di DNA o la base non corrispondente.

Nella fase di replicazione o duplicazione, la DNA polimerasi (di solito la DNA polimerasi I nel caso di E.coli) copierà il DNA stampo per spostare il frammento di DNA non corrispondente o danneggiato. La DNA polimerasi può iniziare la sintesi del DNA dall'estremità 3' in caso di danno o mancata corrispondenza nel frammento di DNA. Infine, nella fase di ligasi, la DNA ligasi aiuta a sigillare il danno rimanente per completare il processo di riparazione per produrre DNA intatto.

Nel meccanismo di riparazione dell'escissione del nucleotide (NER), il nucleotide non corrispondente o danneggiato viene rimosso insieme ai nucleotidi vicini e spostato con i nucleotidi sintetizzato utilizzando un DNA non danneggiato filo come modello. Il meccanismo NER elimina i dimeri pirimidinici formati dopo l'esposizione ad addotti chimici voluminosi o radiazioni UV. La componente fondamentale del danno al DNA riparato dall'escissione del nucleotide è che i nucleotidi danneggiati o modificati causano una distorsione critica nella struttura a doppia elica del DNA. NER si verifica praticamente in tutte le forme di vita.

Gli enzimi che catalizzano NER in E. coli sono l'elicasi UvrD e l'eccinucleasi UvrABC. I geni che codificano per gli enzimi NER sono stati inizialmente considerati mutanti che sono profondamente sensibili ai danni indotti dall'esposizione alla luce UV. Tuttavia, nell'E. coli selvatico, solo l'esposizione prolungata alle radiazioni UV stava uccidendo le cellule.

I ceppi mutanti possono essere riconosciuti come notevolmente più sensibili alle radiazioni UV; questi sono danneggiati nelle loro capacità di funzionamento necessarie per la resistenza ai raggi UV (UV). Raccogliendo un numero enorme di mutanti e testandoli per la loro capacità di ripristinare la protezione o la resistenza dalle radiazioni UV in diverse combinazioni. Nello studio sono stati identificati quattro gruppi di complementazione, che codificano per proteine ​​che svolgono un ruolo significativo nel meccanismo NER; queste proteine ​​sono uvrA, uvrB, uvrC e uvrD.

I geni uvr che codificano per gli enzimi sono stati studiati in modo esauriente. I geni uvrA, uvrB e uvrC codificano per le subunità dell'eccinucleasi UvrABC, che è un enzima multisubunità. Il complesso UvrABC identifica i cambiamenti strutturali indotti dal danno nel DNA, come la formazione di dimeri di pirimidina. Quindi taglia su entrambi i lati il ​​danno.

A quel punto, l'UvrD (noto anche come elicasi II), che viene prodotto a seguito dell'espressione del gene uvrD, provoca lo srotolamento del DNA e aiuta nel rilascio del frammento danneggiato. Di conseguenza, per questo sistema, le proteine ​​UvrABC e UvrD sono coinvolte nel taglio e nell'escissione del DNA danneggiato. lo spazio creato dal taglio viene riempito dall'azione della DNA polimerasi e il segmento appena formato viene sigillato dall'attività della DNA ligasi.

La proteina UvrABC struttura un complesso che identifica il danno e taglia il DNA danneggiato da entrambi i lati (tagli endonucleolitici). L'attività dell'elicasi di uvrD aiuta a rimuovere il frammento asportato di DNA danneggiato. il frammento intatto del DNA dirige la sintesi del gap con l'aiuto della DNA polimerasi e forma un DNA duplex. Ora il frammento di DNA appena formato non è più danneggiato.

In modo più dettagliato, UvrA2 (un dimero) e UvrB identificano il frammento danneggiato dopo aver formato un complesso (UvrA)2 UvrB. UvrA2 si dissocia in seguito dopo aver utilizzato l'ATP. UvrA agisce come ATPasi per l'idrolisi dell'ATP. Dopo la dissociazione di UvrA, UvrB forma un complesso con UvrC nel sito del danno. Ora, questo complesso UvrBC agisce come una nucleasi attiva.

Taglia il DNA da entrambi i lati del danno con l'utilizzo di ATP. La spina dorsale zucchero-fosfato (fosfodiestere) viene scissa in una posizione distante otto nucleotidi dal lato 5' del DNA danneggiato e 4-5 nucleotidi dal lato 3' del DNA danneggiato. Infine, il frammento scisso viene rimosso dall'azione dell'elicasi dell'UvrD. Srotola il DNA ed estrae il frammento scisso. Il frammento di DNA danneggiato si è successivamente dissociato dal complesso UvrBC. Tutti i tre passaggi sopra menzionati richiedono l'idrolisi dell'ATP.

riparazione escissione nucleotidica
Figura: meccanismo di riparazione dell'escissione del nucleotide
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Nucleotide_Excision_Repair-journal.pbio.0040203.g001.png

Il sistema NER è altamente dinamico nelle cellule dei mammiferi, proprio come molti altri organismi. Un tipico DNA delle cellule della pelle presentato alla luce del giorno accumulerebbe migliaia di dimeri ogni giorno se questo ciclo di manutenzione non li eliminasse! Una malattia genetica umana, nota come xeroderma pigmentoso (XP), è un'anomalia della pelle causata da enzimi difettosi che distruggono le lesioni del DNA indotte dai raggi UV.

I fibroblasti dei pazienti XP sono estremamente sensibili alle radiazioni UV quando vengono lasciati crescere in un terreno di coltura, come mostrato dai mutanti uvr di E. coli. Queste linee cellulari XP possono essere coltivate in un terreno di coltura per valutare la capacità di ristabilire la resistenza ai danni UV.

NER opera in due modi nella maggior parte dei mammiferi, lieviti e batteri.

– il sistema di riparazione che agisce sull'intero genoma.

– l'altro sistema di riparazione mostra l'attività associata alla trascrizione.

Il gene XP forma un complesso con la proteina hHR23B che può rilevare il danno al DNA.

Nella riparazione dell'escissione del nucleotide accoppiata con la trascrizione, l'RNA polimerasi mostra una minore attività nel punto di danno sul filamento stampo; forse questa è l'attività di riconoscimento del danno per questo metodo di NER. Uno dei fattori di trascrizione basali che accompagnano l'RNA polimerasi II svolge un ruolo essenziale in entrambi i tipi di NER. Un problema genetico raro nelle persone note come sindrome di Cockayne (CS) è anche correlato a un difetto del fattore accoppiato alla trascrizione.

Sono stati riconosciuti due grappoli di complementazione, CSA e CSB. La determinazione dell'attività enzimatica e degli enzimi naturali da essi codificati fornirà ulteriori conoscenze sul processo di riparazione del DNA trascritto. Il fenotipo dei pazienti con CS è pleiotropico, che esprime invecchiamento precoce, gravi disturbi dello sviluppo e neurologici e sensibilità alla luce. Questi sintomi sono più gravi dei sintomi degli individui XP con meccanismo NER non rilevabile. Ciò indica che le proteine ​​CS (meccanismo di riparazione accoppiato alla trascrizione) hanno alcune funzioni in più oltre alla riparazione per escissione di nucleotidi.

Diverse altre malattie genetiche sono il risultato di un meccanismo di riparazione del DNA da insufficienza. Ad esempio, l'anemia di Fanconi e la sindrome di Bloom. Queste sono attualmente potenziali aree di ricerca. Una risorsa appropriata per informazioni aggiornate sulle malattie genetiche è il portale Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM).

L'atassia telangiectasia (AT) mostra l'impatto delle alterazioni strutturali nella proteina associata al processo di riparazione e le proteine ​​coinvolte nel processo di segnalazione per la corretta riparazione del DNA danneggiato. L'AT è caratterizzata da atassia (andatura irregolare), teleangectasie (dilatazione dei vasi sanguigni oculari e facciali), invecchiamento precoce, immunodeficienze, ritardo mentale, degenerazione cerebellare e più incline alle neoplasie del soggetto.

Quel fenotipo è più preoccupato per il suo locus. Poiché gli eterozigoti, che sono circa l'1% della popolazione, sono anche più inclini a una mutazione nel gene ATM, chiamato "ATM".

Il gene ATM non sembra codificare una proteina direttamente nella riparazione del DNA (diverso dai geni che causano XP dopo la mutazione). L'AT si sviluppa dopo un difetto nella via di segnalazione cellulare a causa delle somiglianze della proteina +difettata con l'altra proteina. Il prodotto del gene ATM può anche essere coinvolto nella progressione del ciclo cellulare e nella regolazione della lunghezza del DNA telomerico.

Il dominio C-terminale delle proteine ​​ATM mostra omologia con la proteina chinasi Ser/Thr (fosfatidilinositolo-3-chinasi); quindi, è coinvolto nelle vie di segnalazione. Le proteine ​​ATM mostrano anche omologia con la proteina chinasi DNA-dipendente, che richiede lacune nel frammento di DNA per mostrare la sua attività chinasica. Questi risultati suggeriscono il coinvolgimento delle proteine ​​ATM nel prendere di mira il meccanismo di riparazione dell'escissione dei nucleotidi.

Polimorfismo a singolo nucleotide

Il polimorfismo a singolo nucleotide (SNP o spesso chiamato "snip") è una variazione genetica molto frequente trovata nel DNA umano. SNP rappresenta la variazione in un singolo nucleotide di DNA in un punto. Supponiamo, ad esempio, che la citosina (C) abbia sostituito la timina (T) in un filamento polinucleotidico di DNA.  

La frequenza di occorrenza di SNP è di uno su 1000 nucleosidi, il che indica che circa 4 milioni di SNP sono presenti nel genoma di ogni essere umano. Dopo aver esaminato attentamente il genoma di 100 milioni di individui, i ricercatori hanno concluso che gli SNP sono presenti nel DNA che si trova tra i geni (di solito gli introni). 

Gli SNP sono considerati biomarcatori per varie malattie, che aiutano i ricercatori a studiare i geni associati a una particolare malattia. A volte, l'SNP ha luogo nella regione dell'esone o nella regione regolatoria del gene, che influisce direttamente sul funzionamento del gene. Quindi, questo SNP interferisce direttamente con la causa della malattia.

SNP
Figura: Dimostrazione del polimorfismo a singolo nucleotide https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Single_nucleotide_polymorphism_substitution_mutation_diagram_-citosina_a_timina.png#/media/File:Single_nucleotide_polymorphism_substitution_mutation_diagram-_citosina_to_timina.png

Generalmente, gli SNP non influiscono sulla salute dell'individuo, ad eccezione di alcuni SNP trovati nella regione dell'esone di un gene e noti per influenzare la funzione del gene. L'analisi SNP è un parametro importante per lo studio della salute umana. L'analisi SNP offre la possibilità di prevedere la disposizione genetica allo sviluppo di una malattia.

L'analisi SNP è molto utile per prevedere il rischio di malattia, la suscettibilità alle tossine e molti altri fattori ambientali, la risposta farmacologica di un individuo, il monitoraggio dei geni legati all'ereditarietà di una particolare malattia in una famiglia. Gli scienziati stanno cercando di sviluppare un processo per identificare gli SNP legati a malattie croniche come cancro, malattie cardiache, diabete ecc. Nel caso di SNP collegati a un tratto, è possibile esaminare i tratti di DNA vicini per determinare i geni responsabili del tratto. 

Applicazioni degli SNP

L'analisi SNP viene utilizzata per determinare la genotipizzazione, il cambiamento del numero di copie nell'espressione genica, l'analisi dell'intero genoma, la mutazione del cancro e l'individuazione di altre malattie. La tecnologia dei microarray SNP può essere utilizzata per rilevare i cambiamenti di dosaggio e il polimorfismo nel DNA di un individuo. L'analisi del microarray SNP è in grado di rilevare piccoli cambiamenti nel numero di copie dell'espressione genica. 

Il microarray SNP utilizzato per la genotipizzazione è in grado di rilevare i cambiamenti nel pattern di metilazione del DNA delle cellule tumorali, i cambiamenti nel genoma e la perdita di eterozigosi. 

I microarray SNP vengono utilizzati anche per la previsione delle malattie, identificando i geni oncosoppressori e gli oncogeni nelle cellule tumorali. Pertanto, gli SNP hanno un buon margine nella selezione di una molecola farmacologicamente attiva, nella prognosi della malattia, nella valutazione del rischio di malignità, ecc.

Quanti nucleotidi compongono un codone?

La sequenza consecutiva di tre nucleotidi nel filamento polinucleotidico di Il DNA o l'RNA costituisce un codone. Il codone è specifico per un amminoacido da incorporare e talvolta il codone interrompe il processo di traduzione. Tali codoni sono noti come codoni di stop. DNA e RNA sono composti in un linguaggio di quattro lettere di nucleotidi; tuttavia, il linguaggio delle proteine ​​incorpora 20 amminoacidi. I codoni danno la chiave che permette a queste due lingue di essere convertite l'una nell'altra.

Ogni codone specifica un amminoacido (tranne tre codoni che fermano il processo di traduzione). L'intero insieme di codoni è noto come codice genetico. Il codice di tre lettere incorpora 64 potenziali combinazioni di nucleotidi di tre lettere dal linguaggio dei quattro nucleotidi del DNA.

codone
Figura: Il codone (una sequenza tripletta di nucleotidi) è riconosciuto da una specifica molecola di tRNA (RNA di trasferimento) che porta gli amminoacidi standard al sito di sintesi proteica.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Codon-Anticodon_pairing.svg#/media/File:Codon-Anticodon_pairing.svg

Dei 64 codoni, 61 codificano per aminoacidi specifici, mentre i restanti tre codoni di stop. Ad esempio, il codone AUG codifica per l'aminoacido metionina e UAA è un codone di stop. Il codice genetico è descritto come degenerato poiché un amminoacido è codificato da più codoni. Il codice genetico è non sovrapposto, il che significa che i codoni vengono letti in continuazione senza ripetere o saltare i nucleotidi.

Codice genetico

Il codice genetico è un insieme di regole che caratterizzano il modo in cui un codice di quattro lettere del DNA viene tradotto nei 20 amminoacidi standard, che aiutano a sintetizzare le proteine ​​del nostro corpo. Il codice genetico è un gruppo di tre nucleotidi noti come codoni, ognuno dei quali si riferisce a un particolare amminoacido oa un codone di stop.

Il concetto di codoni è stato inizialmente descritto da Francis Crick e dai suoi collaboratori nel 1961. Nello stesso anno, Marshall Nirenberg e Heinrich Matthaei hanno eseguito esperimenti per spiegare il codice genetico. Hanno dimostrato che la sequenza di RNA UUU codificava esplicitamente per la fenilalanina (uno dei 20 amminoacidi standard del nostro corpo). Dopo questa scoperta, Nirenberg, Philip e Har Gobind Khorana riconobbero il codice genetico rimanente e rappresentarono interamente ogni codone di tre lettere e i relativi amminoacidi.

codice genetico
Figura: codice genetico
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Genetic_code.svg#/media/File:Genetic_code.svg

Esistono 64 potenziali combinazioni dei codici nucleotidici di tre lettere che possono essere prodotti utilizzando i quattro nucleotidi. Su 64 codoni, 61 corrispondono ad amminoacidi standard e i restanti tre sono segnali di stop/codoni di stop. Sebbene ogni codone sia fissato per un solo amminoacido (o un segnale di stop), il codice genetico è descritto come ridondante perché più codoni possono codificare un amminoacido.

Inoltre, il codice genetico è quasi universale, con alcune rare eccezioni. Ad esempio, i mitocondri hanno codici genetici diversi rispetto al codice genetico cellulare.

Conclusioni

In questo articolo abbiamo discusso degli SNP e del meccanismo di riparazione dell'escissione dei nucleotidi. Per saperne di più sui nucleotidi CLICCA QUI

Intervista Q & A relativa a questo articolo

Q1. Qual è la principale differenza tra un gene e una sequenza nucleotidica?

Risposta: Il gene è l'unità funzionale (capace di esprimere una proteina) del DNA, mentre il nucleotide è l'unità strutturale (capace di formare un elemento costitutivo durante la sintesi) del DNA.

Q2. Qual è la differenza tra polimorfismo a singolo nucleotide SNP e mutazione? Cosa significa polimorfismo?

Risposta: SNP rappresenta la variazione in un singolo nucleotide di DNA in un punto. Supponiamo, ad esempio, che la citosina (C) abbia sostituito la timina (T) in un filamento polinucleotidico di DNA.

 Una mutazione è indicata come qualsiasi cambiamento nella sequenza del DNA. La differenza può essere nella sequenza a singolo nucleotide o forse nella sequenza a più nucleotidi.

Il polimorfismo è la proprietà del DNA (o qualsiasi cosa) di avere più di una o più forme.

Q3. Un singolo nucleotide può avere sia desossiribosio che ribosio? 

Risposta: Un singolo nucleotide può averne solo uno tipo di zucchero. Può essere zucchero ribosio o zucchero desossiribosio.

Q4. Quanti nucleotidi sono presenti nel DNA di un batteriofago?

Risposta: Il DNA del batteriofago contiene diverse migliaia di nucleotidi. Ad esempio, il batteriofago φx174 contiene 5375 nucleotidi.

Q5. Viene prodotta una proteina che contiene sette amminoacidi. Quale sarà la lunghezza dell'mRNA

Risposta: Un codone di 3 nucleotidi codifica un amminoacido. 

Allo stesso modo, sette amminoacidi saranno codificati da 7 x 3 = 21 nucleotidi. 

Ma l'mRNA contiene a codone di arresto (3 nucleotidi) per fermare il processo di traduzione.

Pertanto, l'mRNA che codifica 7 sette amminoacidi conterrà 21 + 3 = 24 nucleotidi.

Q6. Quante molecole d'acqua vengono rimosse durante la formazione di un nucleotide?

Risposta: Due molecole d'acqua verranno rimosse durante la formazione di un nucleotide.

Una molecola d'acqua viene rimossa quando la base azotata si lega allo zucchero ribosio e l'altra molecola d'acqua viene rilasciata quando lo zucchero ribosio si lega al gruppo fosfato.

Q7. L'adenina è un nucleotide o una base azotata?

Risposta: L'adenina è una base azotata, mentre un nucleotide (adenosina monofosfato) contiene un gruppo fosfato, zucchero ribosio e una base azotata (adenina).

Q8. Se il DNA è composto da 6 nucleotidi invece di 4, qual è il numero totale di codoni di triplette possibili?

Risposta: Numero di combinazioni di codoni tripletti = (tipi di nucleotidi)3

Se il DNA contiene sei tipi di nucleotidi, il numero totale di combinazioni di tripli codoni sarà (6)3 = 216

Q9. Come vengono identificati i polimorfismi a singolo nucleotide?

Risposta: I microarray di DNA possono identificare facilmente gli SNP.

Q10. In che modo un virus esprime più proteine ​​della stessa sequenza nucleotidica?

Risposta: I virus lo fanno con due meccanismi:

– Giunzione alternativa

– Sovrapposizione genica

Q11. Perché la sequenza di amminoacidi è molto più corta di quella di nucleotidi?

Risposta: La sequenza amminoacidica è solitamente più corta della sequenza nucleotidica, l'mRNA formato dopo la trascrizione subisce lo splicing e le regioni non codificanti (introni) vengono rimosse e l'mRNA maturo contiene solo le regioni codificanti (esoni)

Q12 Nomina il nucleotide con tre gruppi fosfato.

Risposta: Il nucleotide con tre gruppi fosfato è noto come nucleotide trifosfato. Ad esempio ATP (adenosina trifosfato), GTP (guanosina trifosfato) ecc.

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