Reazione a catena della polimerasi: 9 importanti spiegazioni

Contenuti

Che cos'è la reazione a catena della polimerasi?

Reazione a catena della polimerasi (PCR) è un altro ampiamente utilizzato biologia molecolare tecnica per la produzione enzimatica di DNA senza utilizzare macchinari cellulari, ad esempio lievito o E. coli. Il metodo consente una quantità limitata di DNA essere amplificato diverse pieghe in modo drammatico. PCR è regolarmente utilizzato in clinico, legalee laboratori biologici per vari scopi, come la determinazione impronte genetiche, diagnosi della malattia, clonazione genica, ed test di paternità. 

Questa tecnica è stata creata nel 1983 da Kary Mullis. La PCR è attualmente una procedura cruciale e significativa utilizzata nella biologia applicata. Questi incorporano Clonazione del DNA per il sequenziamento, la filogenesi basata sul DNA o lo studio attivo dell'espressione genica e la determinazione delle malattie a trasmissione genetica. Nel 1993, Mullis ha ricevuto il premio Nobel per la chimica per il suo lavoro sulla PCR. 

La PCR viene generalmente effettuata in una miscela di reazione di un volume totale di 0.1-0.2 ml in provette di reazione (volumi di 0.2-0.5 ml) in uno strumento noto come un termociclatore. Un termociclatore riscalda e raffredda il DNA per raggiungere le temperature richieste in ogni fase della reazione. I tubi di reazione a parete sottile forniscono la conduttività termica desiderata consentendo un più rapido equilibrio termico. Di solito, i termociclatori hanno parti superiori o coperchi riscaldati che prevengono la condensazione dei componenti di reazione nella parte superiore del tubo. 

Requisiti della reazione a catena della polimerasi

• DNA frammento da amplificare (DNA stampo o cDNA)
• Primer (forward primer e reverse primer) in grado di riconoscere le estremità del DNA stampo. I primer sono generalmente lunghi 18-25 paia di basi.
• Termostabile DNA polimerasi (Taq polimerasi) catalizza la sintesi del DNA. Si ottiene la Taq polimerasi Thermus acquatico.
• Nucleotidi
• Buffer (fornisce un mezzo ottimale per l'attività della DNA polimerasi termostabile)

Principio di funzionamento della reazione a catena della polimerasi

La PCR è chiamata reazione a catena perché i filamenti appena sintetizzati fungeranno da stampo per l'ulteriore sintesi del DNA nei cicli successivi. 

La PCR consiste in 3 reazioni successive:

• Denaturazione del DNA: Il processo di denaturazione separa i filamenti di DNA a doppio filamento. Per il DNA umano, il temperatura di denaturazione è di circa 93-95°C. La denaturazione del DNA avviene rompendo i legami idrogeno tra i due filamenti polinucleotidici del DNA. Il processo di denaturazione viene spesso eseguito per 5 minuti o per un tempo prolungato per garantire che entrambi i filamenti del DNA stampo siano completamente separati l'uno dall'altro. Il processo di denaturazione attiva anche la DNA polimerasi termostabile.
• Ricottura primer: Dopo la denaturazione, nella miscela di reazione vengono introdotti primer diretti e inversi. La soluzione viene quindi raffreddata per la ricottura del primer. Di solito, la ricottura del primer avviene tra 50 e 70^oC a seconda della Tm (temperatura di fusione) del DNA. Idealmente, la temperatura di ricottura è 5^oC sotto la Tm. La temperatura di ricottura dovrebbe essere bassa per formare un ibrido tra il primer e il DNA stampo e sufficientemente alta per evitare ibridi non corrispondenti. La Tm del DNA dipende esclusivamente dal contenuto di GC e AT del DNA. La fase di ricottura del primer richiede solitamente 1-2 minuti. Tm può essere determinato sperimentalmente o calcolato teoricamente dalla formula menzionata di seguito:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]^oC

• Sintesi del DNA: la DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi) si lega vicino al regione di legame dell'RNA e incorpora i nucleotidi liberi allungare e sintetizzare un nuovo filamento di DNA adiacente al filamento stampo. La temperatura ottimale della fase di estensione dipende dal tipo di polimerasi utilizzata; per la Taq polimerasi, la temperatura ottimale è di circa 72^oC. La durata di questa fase di estensione dipende dalla lunghezza del DNA stampo e dall'efficienza della DNA polimerasi termostabile; di solito, è una coppia di kilobase al minuto.

Tutte le reazioni sopra menzionate vengono ripetute 30 volte per ottenere circa 1 miliardo di copie del DNA stampo.

Fasi della reazione a catena della polimerasi

Il processo di PCR si divide in tre fasi:

• Amplificazione esponenziale: La DNA polimerasi svolge la funzione ottimale e, dopo il completamento di ogni ciclo, la quantità di prodotto viene raddoppiata. Solo una piccola quantità di DNA deve essere presente al punto di inizio della reazione poiché la reazione è molto sensibile.
• Fase di livellamento: La DNA polimerasi mostra un'attività minore a causa della minore disponibilità di reagenti come i nucleotidi.
• Vassoio: non si forma più prodotto a causa dell'esaurimento del reagente.

Usi della reazione a catena della polimerasi

La PCR può essere utilizzata per identificare numerose anomalie legate al genoma, un'ampia gamma di analisi e sperimentazioni. Di seguito vengono discussi alcuni esempi di utilizzo della PCR:

• Identificazione di agenti infettivi come CMV, Micoplasma, Polmonite, malattie contagiose e correlate ai protozoi, epatite, ecc. nel campione.
• Determinazione della neoplasia, in particolare nel caso di linfoma e leucemia. 
• Test di paternità e fingerprinting genetico. 

La PCR consente l'identificazione precoce delle anomalie che sono attualmente le più sviluppate nella ricerca sul cancro. Le misurazioni della PCR possono essere eseguite direttamente sui campioni di DNA genomico per riconoscere cellule maligne specifiche di traslocazione con una sensibilità di oltre 10,000 volte rispetto a qualsiasi altro metodo. 

La PCR identifica anche microrganismi non coltivabili ea crescita lenta, come micobatteri, microrganismi anaerobici e virus, da tecniche di coltura di tessuti e modelli basati su animali. Le applicazioni dimostrative della PCR in microbiologia sono il riconoscimento di agenti patogeni e la capacità di farlo distinguere tra ceppi non patogeni da ceppi patogeni identificando i geni specifici. 

La PCR viene utilizzata per intensificare un breve pezzo di un filamento di DNA. Questo filamento di DNA può essere un gene completo o semplicemente una parte di un gene. A differenza dei sistemi viventi, il ciclo PCR può amplificare solo brevi frammenti di DNA fino a 10 paia di kilobase. Varie altre tecniche possono amplificare frammenti di DNA fino a 40 kb di dimensione, che è comunque inferiore alla dimensione di DNA cromosomico di un eucariotico cellula – ad esempio, una cellula umana contiene circa tre miliardi di coppie di basi nucleotidiche. 

Test paterno può essere eseguito utilizzando la PCR prelevando il DNA delle persone che hanno la controversia. Il DNA degli individui del test viene amplificato e digerito enzimi di restrizione e analizzato con elettroforesi su gel. Il modello dei frammenti di DNA sul gel di agrosio è noto come l'impronta digitale del DNA dell'individuo. Gli individui strettamente o consanguinei avranno un simile DNA impronte digitali modello rispetto agli individui lontanamente imparentati o non imparentati. Le impronte digitali ottenute possono essere ulteriormente analizzate per il genitore-figlio o fratelli con due o più impronte genetiche (DNA). Il Le impronte del DNA ottenute possono essere utilizzate per sapere le relazioni evolutive tra gli organismi. 

Le sue dimensioni possono facilmente riconoscere il prodotto finale della PCR elettroforesi su gel di agarosio. L'elettroforesi su gel di agarosio viene eseguita iniettando i campioni di DNA nel gel di agarosio. La corrente elettrica viene fatta passare attraverso il gel di agarosio per conoscere la mobilità dei campioni di DNA. I frammenti di DNA più piccoli si muovono più velocemente nel gel e viceversa. Il prodotto della PCR e il frammento di DNA del campione vengono identificati introducendo una scala di DNA nel gel di agarosio. La scala del DNA contiene molecole di DNA di dimensioni note. 

In precedenza, l'identificazione della malattia genetica mediante l'osservazione del genoma era un lavoro difficile. Successivamente, con lo sviluppo della PCR, questo processo viene abbreviato. Qualsiasi gene di interesse può essere facilmente amplificato utilizzando primer adatti e quindi sequenziato per rilevare mutazioni nel DNA. L'identificazione precoce di alcune infezioni virali letali può essere effettuata anche tramite PCR. 

Tipi di reazione a catena della polimerasi

Sulla base di alcune opportune modifiche nella tecnica, Reazione a catena della polimerasi è classificato nelle seguenti tipologie:

• PCR annidata
• PCR inversa
• Trascrizione inversa (RT-PCR)
• PCR asimmetrica
• Quantitativo (PCR-Q-PCR)
• PCR quantitativa in tempo reale (QRT-PCR)
• PCR touchdown
• PCR di colonia
• PCR allele-specifica
• PCR assemblaggio o assemblaggio ciclico della polimerasi (PCA)
• PCR asimmetrica
• Lineare dopo la PCR esponenziale (LATE-PCR)
• PCR dial-out
• Amplificazione dipendente dall'elicasi
• PCR con avvio a caldo
• PCR inter-sequenza specifica
• PCR inversa
• PCR mediata dalla legatura
• PCR specifica per la metilazione
• PCR con miniprimer

Vantaggi della reazione a catena della polimerasi

• La reazione a catena della polimerasi può essere utilizzata per l'identificazione di una varietà di anomalie genetiche.
• La PCR viene utilizzata in un'ampia gamma di esperimenti e procedure di laboratorio in biologia molecolare.
• La PCR può rilevare tumori maligni come leucemia, linfoma, ecc. E varie altre condizioni come Toxoplasma gondi, batteriemia da stafilococco, infezioni malariche, ecc.
• L'impronta genetica e il test di paternità coinvolgono la PCR come passaggio cruciale.
• L'elevata sensibilità e specificità della PCR lo rende uno strumento importante per esperimenti basati sulla biotecnologia e sulla biologia molecolare.

Svantaggi della reazione a catena della polimerasi

• La reazione a catena della polimerasi richiede un termociclatore, un assemblaggio elettroforetico del DNA, un kit di isolamento del DNA e altre sostanze chimiche costose, che rendono il processo costoso.
• Richiede tecnici formati, qualificati ed esperti per condurre esperimenti.
• Sono necessari laboratori di livello di sicurezza di base con deumidificatori e impianti a flusso laminare.
• È difficile permettersi test basati su PCR per il pubblico regolare.
• Non tutte le malattie possono essere identificate e diagnosticate tramite PCR.
• Possibilità di ottenere risultati falsi positivi e falsi negativi.

La reazione a catena della polimerasi è una tecnica comunemente utilizzata e ampiamente accettata per l'identificazione di diversi agenti infettivi letali con sensibilità e specificità. La PCR viene utilizzata in vari centri medici di strutture avanzate, laboratori moderni e istituti medici come modulo diagnostico e di ricerca di routine. La reazione a catena della polimerasi gioca un ruolo cruciale nell'identificazione di anomalie che rappresentano sintomi clinici atipici; La PCR consente la diagnosi precoce di questi tipi di menomazioni. La diagnosi precoce può aiutare a gestire l'individuo in modo molto migliore, il che può ridurre l'onere sociale ed economico sulla famiglia del soggetto.

Per saperne di più su altri argomenti su Biosintesi e Biotecnologie clicca qui

MCQ per il controllo del concetto

Domanda n. 1: Uno studente sta eseguendo la PCR per amplificare un campione di DNA stampo. Ma si è dimenticato di aggiungere il primer al DNA nell'esperimento. Quale delle seguenti opzioni rappresenta il miglior risultato possibile?

A- La reazione non avrà luogo.

B- La reazione funzionerà, ma il processo amplificherà le regioni non specifiche (non la porzione di DNA desiderata del DNA.

C- La reazione funzionerà ma a un ritmo prolungato

La reazione D funzionerà e il prodotto mostrerà mutazioni indesiderate.

Opzione A: "La reazione non avrà luogo" è la risposta corretta.

Spiegazione: I primer sono essenziali per il funzionamento della PCR. La Taq polimerasi ne ha bisogno per il legame (nella fase di ricottura) per iniziare replicazione del DNA. Pertanto la PCR non funzionerà in assenza di primer e non avrà luogo alcuna amplificazione.

Domanda n. 2: Uno studente / ricercatore desidera inserire il gene dell'emoglobina umana in un vettore di espressione per clonare ed esprimere il gene nelle cellule di topo per analizzare il fenotipo risultante. Quale delle seguenti sequenze di procedure consentirà allo studente / ricercatore di clonare il gene con successo?

Opzione A:

1. Amplificare il gene tramite PCR

2. Utilizzare un enzima di restrizione per tagliare il vettore di espressione

3. Gene Ligate e vettore digerito

Opzione B: 

1. Gene Ligate

2. Utilizzare un enzima di restrizione per tagliare il vettore di espressione 

3. Amplificare il gene e il vettore di espressione digerito tramite PCR

Opzione C:

1. Utilizzare un enzima di restrizione per tagliare il vettore di espressione

2. Amplificare il gene tramite PCR

3. Gene Ligate e vettore digerito

Opzione D:

1. Utilizzare un enzima di restrizione per tagliare il vettore di espressione

2. Gene Ligate e vettore digerito

3. Amplificare il gene tramite PCR

Opzione A: È il correggere opzione 

1. Amplificare il gene tramite PCR

2. Utilizzare un enzima di restrizione per tagliare il vettore di espressione

3. Gene Ligate e vettore digerito

Spiegazione: in primo luogo, useremo la PCR per amplificare il gene di interesse dal genoma umano con siti di restrizione alle estremità (questo aiuterà la sua legatura a una restrizione enzima digerito vettore). Successivamente, il vettore di espressione deve essere digerito utilizzando lo stesso enzima di restrizione, quindi il vettore digerito e il gene amplificato sono stati ligati insieme. Il prodotto finale sarà costituito da due segmenti: il vettore originale e il gene di interesse.

Domanda n. 3: Quale strumento viene utilizzato per completare l'amplificazione del DNA tramite PCR?

A- Analizzatore genetico

B- Spettrofotometro UV

C- Termociclatore

D- Centrifuga

Opzione C: Il termociclatore è la risposta corretta

Spiegazione: Il termociclatore può essere impostato per azionare un ciclo delle fasi di denaturazione, ricottura ed estensione, rispettivamente, in una piccola quantità del volume di reazione. Un termociclatore viene utilizzato per eseguire l'amplificazione PCR.

Per ulteriori post sulla scienza avanzata, segui questo link.

Leggi anche:

• Grassi monoinsaturi vs grassi polinsaturi
• I mitocondri hanno un nucleo
• Esempi di biota
• Esempi di grassi polinsaturi
• Esempio di proteina a cellula singola
• Un cromosoma è un plasmide
• Caratteristiche delle meduse lunari
• Come sono fatti i tratti
• Esempi di acidi nucleici
• Esempi di trilobiti

Dott. Abdullah Arsalan

Sono Abdullah Arsalan, ho completato il mio dottorato di ricerca in Biotecnologie. Ho 7 anni di esperienza di ricerca. Ho pubblicato finora 6 articoli su riviste di fama internazionale con un Impact Factor medio di 4.5 e pochi altri sono in considerazione. Ho presentato lavori di ricerca in vari convegni nazionali ed internazionali. La mia area di interesse è la biotecnologia e la biochimica con particolare attenzione alla chimica delle proteine, all'enzimologia, all'immunologia, alle tecniche biofisiche e alla biologia molecolare.