Meccanismo di trascrittasi inversa: 9 fatti importanti

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Trascrizione

La trascrizione è l'inizio di "Espressione genica".

In questo processo, le informazioni contenute nel "codice genetico di quattro lettere del DNA" vengono trasferite nel codice genetico di tre lettere dell'RNA. "

, possiamo spiegare la trascrizione poiché crea una copia dell'RNA dal DNA o l'informazione genetica viene trasferita dal DNA all'RNA.

Il processo di trascrizione coinvolge un enzima noto come RNA polimerasi; questo enzima utilizza il DNA come stampo e facilita il collegamento dei nucleotidi per formare l'RNA (corrispondente e complementare alla sequenza del DNA stampo).

Il processo di trascrizione si completa in tre fasi.

Fase 1: iniziazione

Fase 2: allungamento

Fase 3: risoluzione

Trascrizione eucarioticajpg
Figura: tre passaggi fondamentali della trascrizione (processo di trasferimento delle informazioni genetiche dal DNA all'RNA); Iniziazione, allungamento e terminazione https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Eukaryotic_Transcription.png

Negli eucarioti, alcune fasi sono note come modifiche post-traduzionali si verificano anche in cui l'RNA subisce modifiche come:

Splicing

5'-capping

Poly A incorporazione della coda

Nota importante: La trascrizione avviene separatamente per ogni singolo gene presente nel nostro genoma.

Il DNA ha geni enormi, ogni gene codifica per un gene. La trascrizione sta copiando le informazioni del gene che codifica la proteina in una trascrizione di RNA.

Trascrittasi

Le trascrittasi sono gli enzimi che catalizzano la sintesi dell'RNA dal DNA stampo; questo processo è noto come trascrizione. Le trascrittasi inverse (RT) sono gli enzimi che catalizzano la formazione di cDNA (DNA complementare) dallo stampo di RNA; questo processo è noto come trascrizione inversa.

Trascrizione inversa

In fase di trascrizione inversa, Il DNA è sintetizzato da un modello di RNA (opposto al processo di trascrizione, in cui l'RNA viene sintetizzato dal modello di DNA). Il DNA prodotto nella trascrizione inversa è noto come DNA complementare (cDNA). La trascrizione inversa è effettuata da un enzima noto come trascrittasi inversa. 

Requisiti della trascrittasi inversa:

           Modello di RNA

           Primer corto (per il legame con l'estremità 3 'dell'RNA)

Il primer corto si lega alla regione complementare all'estremità 3 ′ e avvia la sintesi del DNA complementare. Questo cDNA viene utilizzato nella PCR (reazione a catena della polimerasi) come DNA stampo. Il cDNA viene quindi convertito in DNA a doppio filamento dall'azione della DNA polimerasi e della DNA ligasi. Questa combinazione di PCR e RT-PCR (una combinazione di reazione a catena della polimerasi e trascrizione inversa) consente di rilevare quantità minime di RNA presenti nel campione. La trascrizione inversa viene spesso utilizzata nella clonazione per aumentare il numero di copie. 

Trascrizione inversa
Figura: schema di trascrizione inversa, la RT si lega all'ssRNA e dirige la sintesi del cDNA che successivamente si converte in dsDNA. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.jpg

Diversi RT ingegnerizzati vengono spesso utilizzati per aumentare l'efficienza della formazione del prodotto. L'RT ingegnerizzato garantisce la copia completa dell'estremità 5 'dell'mRNA. Gli RT termostabili sono progettati anche per il loro utilizzo a temperature più elevate.

Che cosa sintetizza la trascrittasi inversa?

La trascrittasi inversa facilita la sintesi del DNA dal genoma dell'RNA virale. Questo DNA di nuova formazione è noto come DNA complementare (cDNA). La RT è principalmente presente nei virus contenenti il ​​genoma dell'RNA. Il genoma dell'RNA contenente virus è noto come retrovirus.

Qual è la funzione della trascrittasi inversa?

La trascrittasi inversa è una DNA polimerasi dipendente dall'RNA (richiede l'RNA come stampo per sintetizzare il cDNA). La RT identifica e lega l'RNA per sintetizzare RNA single-standing (ssRNA). Dopo aver sintetizzato il cDNA, RT scinde l'RNA e inizia a sintetizzare il DNA a doppio filamento (dsDNA).   

La trascrittasi inversa ha due siti attivi (siti attivi) per eseguire due funzioni separate:

Sito attivo della polimerasi: comprende due domini simili a dita; un dominio può identificare l'RNA e forma legami idrogeno con gruppi fosfato utilizzando catene laterali.

La formazione del legame idrogeno determina i cambiamenti conformazionali e facilita la chiusura del foro di riconoscimento; ciò si traduce nell'avvio del processo di trascrizione (mediante l'aggiunta di nucleotidi) con l'aiuto degli ioni magnesio del secondo dominio.

La zona flessibile governa il processo di cambiamento conformazionale; questa zona flessibile è presente tra i domini del sito attivo della polimerasi. È spesso considerato un sito target per inibire l'attività RT durante gli studi biochimici e farmacologici. La sequenza amminoacidica presente nella zona flessibile non viene conservata (cambia molto nel corso dell'evoluzione), il che consente al virus di sviluppare resistenza.

Dominio Ribonucleasi H: è responsabile della scissione del rilascio di RNA e ssDNA. Lo ione magnesio aiuta il dominio della ribonucleasi H nel riconoscimento dei gruppi fosfato. La seconda catena del dominio della ribonucleasi H non ha attività enzimatica. Interagisce e stabilizza solo il sito attivo.

La ricerca è ancora in corso sull'esatto meccanismo catalitico della RT; lo schema sopra citato è l'idea di base della catalisi fatta da RT.

A differenza della DNA polimerasi, RT manca di attività di correzione di bozze a causa dell'assenza del frammento di Klenow. La mancanza di attività di correzione di bozze produce più errori nella trascrizione, il che porta a enormi possibilità di mutazioni del virus.

Transcrittasi inversa dei retrovirus

Le particelle virali di tutti i retrovirus contengono un enzima multifunzionale noto come RT. Questo RT è necessario per sintetizzare la copia del DNA del genoma dell'RNA di un retrovirus non appena entra in una cellula ospite. 

La determinazione della struttura 3D della trascrittasi inversa ha rivelato le interazioni tra i due siti attivi, inclusi il legame e la catalisi. La conoscenza strutturale dell'enzima ci offre l'opportunità di studiare nuovi farmaci antivirali per il trattamento dei retrovirus.

Transcrittasi inversa dell'HIV

Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è responsabile della diffusione della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). L'HIV codifica principalmente per quattro tipi di subunità proteiche che esibiscono DNA polimerasi, RNasi H, integrasi e attività simile alla proteasi. L'attività della DNA polimerasi e della RNasi H sono possedute da una singola subunità della trascrittasi inversa dell'HIV (enzima eterodimerico).

Per convertire l'RNA genomico del virus nel dsDNA in una cellula ospite, la trascrittasi inversa dell'HIV mostra sia l'attività della RNasi H che quella della DNA polimerasi. La ricerca sta proseguendo per conoscere il meccanismo di come la trascrittasi inversa dell'HIV dispiega la sua sottounità (dominio della ribonucleasi H) per idrolizzare il genoma (RNA) del retrovirus. I siti e la conformazione della trascrittasi inversa per la sintesi del DNA e l'idrolisi dell'RNA sono diversi. Questa distinzione nella conformazione e nella rivelazione della cavità strutturale lo rende un potenziale candidato bersaglio per l'inibizione della trascrittasi inversa.

HIVRT
Figura: Struttura della trascrittasi inversa dell'HIV durante la sintesi del cDNA, di solito la RT dell'HIV ha due siti attivi. un sito catalitico ha la funzione della polimerasi mentre l'altro ha attività nucleasica. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcriptase_3KLF_labels.png

Nota importante: L'attività della RNasi H della trascrittasi inversa dell'HIV dipende totalmente dalla sequenza amminoacidica del sito attivo. Il meccanismo attuale è ancora da scoprire.

Conclusioni

Questo articolo ha discusso gli eventi di trascrizione, trascrizione inversa e l'importanza della trascrittasi inversa nei retrovirus. Per maggiori dettagli su argomenti correlati, clicca qui.

FAQ

Q1 Qual è il ruolo della trascrittasi inversa

Rispondi al l'enzima RT è anche noto come RNA DNA polimerasi dipendente; catalizza la trascrizione dell'RNA genomico retrovirale in cDNA.

Q2 Da dove viene la trascrittasi inversa

Risposta: Il processo di trascrizione inversa si verifica in una certa misura nei retrovirus, nei procarioti e persino negli eucarioti. È coinvolto nella sintesi del cDNA dall'RNA. I retrovirus hanno RT, che dipendono dall'RNA per sintetizzare il cDNA. La divisione nucleare non prevede l'uso di RT. Un enzima noto come telomerasi è presente negli eucarioti. La telomerasi è una RT specializzata che sintetizza il DNA telomerico (presente sulla punta dei cromosomi) dall'RNA.

Q3 Quali organismi hanno la trascrittasi inversa

Rispondi al l'enzima RT è presente in molti organismi come le piante, animali, batteri e virus. Il ruolo dell'enzima RT è convertire una sequenza di RNA in una sequenza di cDNA. È generale in tutti gli organismi. Le funzioni specifiche di RT includono:

Propagazione del retrovirus

Diversità dei trasposoni mobili eucariotici o dei retrotrasposoni

Replicazione o sintesi dei telomeri

Sintesi di DNA multi-copia a filamento singolo (msDNA), DNA / RNA extracromosomico ed elementi chimerici.

D4 Gli esseri umani producono la trascrittasi inversa.

Risposta: Sì, gli esseri umani esprimono la trascrittasi inversa; la telomerasi è un tipo di trascrittasi inversa. Si trova in molti eucarioti. Gli esseri umani portano un modello di RNA della telomerasi per formare il DNA telomerico.

Q5 Come si previene la trascrittasi inversa

Risposta: L'attività della trascrittasi inversa può essere prevenuta utilizzando potenti inibitori enzimatici. Questi inibitori (specificamente per le RT) sono generalmente agenti antiretrovirali. Gli inibitori limitano la RT formando cDNA dall'RNA virale e quindi bloccano la propagazione del virus.

Q6 Qual è la differenza tra PCR in tempo reale e trascrittasi inversa

Risposta: La PCR della trascrittasi inversa (RT-PCR) è molto più sensibile della normale PCR. La RT-PCR viene spesso utilizzata per rilevare l'espressione di un particolare gene, il sequenziamento del DNA, la clonazione del DNA, il monitoraggio delle malattie ereditarie e l'analisi dei geni funzionali. Al contrario, la PCR generale è ampiamente utilizzata per scopi di amplificazione del DNA.

Q7 Perché l'RNA viene convertito in cDNA

Risposta: la trascrittasi inversa di solito trascrive l'RNA stampo in cDNA. 

Il cDNA è generalmente utilizzato in biologia molecolare per la clonazione geni eucariotici nella cellula procariotica fabbriche. Ogni volta che vogliamo esprimere una proteina (di fonte esterna) in una cellula che normalmente non sintetizza tale proteina, è necessaria una trasformazione del cDNA nella fabbrica di cellule procariotiche.

Q8 Qual è la differenza tra QPCR e RT-PCR

Risposta: entrambe le tecniche sono correlate e utilizzate per produrre / amplificare copie di DNA. RT-PCR amplifica la trascrizione inversa del codice RNA, mentre Q-PCR misura il processo di amplificazione. Q-PCR è per la quantificazione, mentre RT-PCR è per le amplificazioni. La Q-PCR è quantitativa, mentre la RT-PCR è di natura non quantitativa.

Q9 Può la trascrittasi inversa usare il DNA come modello.

Risposta: La trascrittasi inversa utilizza l'RNA a filamento singolo come modello per sintetizzare la copia del DNA a doppio filamento. Gli RT non usano il DNA come modello.

Q10 Qual è la caratteristica distintiva della trascrittasi inversa

Risposta: La caratteristica distintiva della trascrittasi inversa è trasferire l'informazione genetica dall'RNA al DNA. 

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